новости разведки

новости генетика

тема недели

интересное о предках

новое о динозаврах

ботаника

статьи Соколова Д.Б.

зоология

юриспруденция

биографии великие

словарь терминов

Юмор

каталог сайтов

друзья

новости сайта

награды сайта

биннеры сайта

об авторе

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Доклиническая диагностика семейной гиперхолестеринемии с помощью анализа ДНК

С. Р. Крапивнер, П. П. Малышев, А. Б. Полтараус, А. Н. Мешков, В. В. Кухарчук, В. Н. Бочков

Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава Российской Федерации,

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва


 

При обследовании пациентов с клиническим диагнозом "семейная гиперхолестеринемия" (СГХС) методом анализа конформации одноцепочечной ДНК была обнаружена новая мутация (230insG) в гене рецептора липопротеидов низкой плотности. Анализ ДНК, проведенный в семье пробанда, позволил выявить двух носителей данной мутации, у которых клинические проявления атеросклероза отсутствовали. Эти больные взяты под наблюдение, что позволит проследить фенотипическую экспрессию данной мутации и оценить эффективность мер первичной профилактики атеросклероза у ее носителей. Работа демонстрирует преимущества методов ДНК-анализа для обнаружения СГХС на доклинической стадии.

Ключевые слова:

семейная гиперхолестеринемия, ЛПНП-рецептор, мутация.

Многочисленные исследования убедительно показали, что повышенный уровень холестерина (ХС) в крови сопровождается увеличением риска развития атеросклероза и его осложнений [1]. Этот риск особенно велик при первичных моногенных гиперхолестеринемиях, наиболее изученной формой которых является семейная гиперхолестеринемия (СГХС) [2]. При этом заболевании в результате мутации нарушается функционирование мембранного белка-рецептора липопротеидов низкой плотности (ЛПНП-рецептора). Этот наследственный дефект приводит к снижению клиренса липопротеидных частиц и вследствие этого к резкому повышению уровня ХС в плазме крови [3]. В настоящее время разработаны разнообразные лекарственные и афферентные способы коррекции гиперхолестеринемии [1, 4]. Клинические исследования продемонстрировали высокую эффективность этих методов для первичной и вторичной профилактики атеросклероза, в том числе у больных с СГХС [5-9]. К сожалению, клиническая и биохимическая диагностика СГХС сопряжена с определенными сложностями, вследствие чего даже в лучших клиниках диагноз СГХС в большинстве случаев ставится лишь после появления клинической симптоматики [4]. В результате диетические и лекарственные способы первичной профилактики атеросклероза у таких больных не используются в должной мере. Согласно оценкам экспертов ВОЗ, наиболее эффективным способом обнаружения СГХС на доклинической стадии является анализ ДНК родственников больных с установленным генетическим дефектом [10]. В настоящей работе этот подход был применен для проведения доклинической диагностики в семье пробанда, у которого мы обнаружили не описанную ранее перестройку в гене ЛПНП-рецептора. В результате ДНК-обследования трех поколений этой семьи, помимо пробанда, были обнаружены два носителя мутации, у которых атеросклероз не достиг клинической стадии.

Материал и методы

В работе использованы соли и буферы производства фирмы "Sigma" (США), реактивы для электрофореза и стандарты размера ДНК фирмы "Life Technologies" (Ве-ликобритания), а также реактивы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) фирмы "Promega" (США). Скрининг на выявление мутаций в гене ЛПНП-рецептора проведен среди больных с клиническими признаками СГХС, наблюдавшихся в Институте клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздрава Российской Федерации. Большинство обследованных были русской национальности и проживали в Москве и Московской области. Диагноз СГХС ставили на основании следующих критериев: при уровне общего ХС выше 7,8 ммоль/л, наличии сухожильных ксантом у обследуемого или родственников первой степени родства и отсутствии заболеваний, приводящих к развитию вторичной гиперлипопротеидемии, таких как сахарный диабет, гипотиреоз и нефротический синдром.

Анализ липидов крови проводили на анализаторах "Technicon-RX" (фирма "Technicon", США) и "Spectrum" (фирма "Abbott Laboratories", США). ХС ЛПВП определяли в супернатанте после преципитации апо-B-содержащих липопротеидов декстрансульфатом.

ДНК выделяли из крови или буккального мазка обследуемых лиц с помощью стандартных процедур [11]. ПЦР (35 циклов) проводили в термоциклере фирмы "Hybaid" при следующих условиях: денатурация (94°С, 30 с), отжиг (57°С, 30 с) и элонгация (72°С, 32 с). В конце реакции пробирки дополнительно инкубировали при 72°С в течение 10 мин. ПЦР проводили в объеме 20 мкл в растворе следующего состава: 100 мМ трис-HCl, pH 8,3 (25°С), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (каждый в концентрации 100 мкМ), по 10 пмоль каждого праймера, 2 ед. Taq-полимеразы и 1 мкг геномной ДНК. Для амплификации 3-го экзона гена ЛПНП-рецептора использовали следующие праймеры [12]: 5'-TTCCTTTGAGTGACAGTTCAATCC-3' и 5'-GAT-AGGCTCAATAGCAAAGGCAGG-3'.

После окончания ПЦР 3 мкл продукта смешивали с 20 мкл 7,5% раствора фикола-400 и 0,025% ксиленцианола FF, нагревали 2 мин при 95°С, после чего пробирки немедленно помещали на лед. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в неденатурирующем полиакриламидном геле (T=15%, C=2%) размером 160Х140Х0,75 мм. В качестве гелевого и электродного буфера использовали 1ХTBE. Форез проводили в течение ночи при 4°С и фиксированной силе тока 10 мА/гель. После окончания электрофореза гель окрашивали серебром [13]. Амплифицированные фрагменты из образцов с аномальной картиной миграции одноцепочечной ДНК очищали из исходной ПЦР-смеси электрофорезом в 8% полиакриламидном геле в TBE-буфере без предварительной денатурации, после чего их обнаруживали в геле с помощью бромистого этидия, вырезали и элюировали из геля водой. После переосаждения и измерения концентрации полученную ДНК секвенировали.

Нуклеотидную последовательность продуктов ПЦР определяли методом циклического секвенирования с использованием набора ABI PRISM и автоматического ДНК-секвенатора 375А фирмы "Applied Biosystems". Секвенирование проводили дважды с использованием прямого и обратного праймеров. 

Результаты исследования

Для поиска мутаций в гене ЛПНП-рецептора мы использовали метод анализа конформации одноцепочечной ДНК с помощью гель-электрофореза [14]. В ходе скрининга больных с клиническим диагнозом СГХС мы обнаружили пациента (пробанд, обозначенный на рис.1 и 2 цифрами I.1), у которого в амплифицированном 3-м экзоне на электрофореграмме наблюда-лись дополнительные полосы (на рис. 1, А обозначены звездочками). Секвенирование ДНК пациента I.1 показало наличие в одном из аллелей дополнительного нуклеотида G после нуклеотида с порядковым номером 230 [15]. Согласно распространенной номенклатуре, такую мутацию сокращенно следует обозначать 230insG [16]. Результатом этой инсерции является сдвиг рамки считывания начиная с 57-го кодона (см. рис.1, Б). В результате образуется преждевременный стопкодон в положении 108. Таким образом, в отличие от нормальной последовательности, содержащей 860 аминокислотных остатков, мутантная мРНК кодирует сильно укороченный полипептид длиной 108 аминокислот, 56 из которых соответствуют половине лигандсвязывающего домена ЛПНП-рецептора, а остальные представляют собой бессмысленную последовательность, вызванную сдвигом рамки. На основании имеющейся информации о функциональных последствиях различных типов мутаций ЛПНП-рецептора [17] можно с высокой вероятностью предположить, что данный полипептид не способен связывать липопротеиды и скорее всего в процессе созревания не достигает клеточной поверхности. Такую мутацию можно отнести ко II функциональному классу [17]. Результатом подобных нарушений в гетерозиготном состоянии обычно является утрата половины ЛПНП-связывающей способности клеток за счет полной инактивации мутантного аллеля. Анализ электронных баз данных [18, 19] показал, что такая мутация обнаружена нами впервые и, по-видимому, является специфичной для России.

 

Пробанд - мужчина, русский, родился в Ашхабаде, единственный ребенок в семье. В 1995 г. в возрасте 56 лет перенес передний инфаркт миокарда (документированный), а гиперхолестеринемия была обнаружена у него лишь спустя год. Пациент впервые обратился в нашу клинику в 1997 г. При обследовании у больного были выявлены ксантомы сухожилий кистей, ахилловых сухожилий и выраженная липоидная дуга роговицы. Клинически был установлен диагноз СГХС. При ультразвуковой допплерографии были обнаружены двусторонние стенозы в области бифуркации общих сонных и в устье внутренних сонных артерий.

Сведения об отце пробанда отсутствуют, о матери известно, что она родилась в Саратовской области, погибла во время землетрясения, братьев и сестер у нее не было. Со слов пробанда, сосудистых заболеваний (инфаркта миокарда, инсульта, перемежающейся хромоты) у нее не было.

Для выявления носителей мутации 230insG были обследованы родственники больного I.1 (см. рис. 2). Анализ ДНК показал, что дочь (II.2) и старшая внучка пробанда (III.1) унаследовали мутантный аллель, тогда как его сын (II.3) здоров (см. рис.1,А). Данные измерения липидов согласуются с результатами ДНК-анализа (см. таблицу 1). При физикальном обследовании у дочери пробанда (33 лет) выявлена липоидная дуга роговицы слабой степени выраженности, при проведении велоэргометрии данных о наличии ишемии миокарда не получено. У внучки пробанда (14 лет) при осмотре клинических проявлений СГХС не обнаружено. В дополнительном исследовании был проведен анализ ДНК, выделенной из буккального мазка, взятого у младшей внучки пробанда. Согласно результатам электрофоретического анализа, мутация 230insG у нее отсутствует (данные не приведены).

 

Таблица 1. Показатели липидов сыворотки крови у носителей мутации и здорового родственника
Обследуемые Общий ХС, ммоль/л ТГ, ммоль/л ХС ЛПВП, ммоль/л ХС ЛПНП, ммоль/л Возрастная норма ХС ЛПНП*, ммоль/л
Носители мутации
Пробанд (I.1) 9,36 1,26 0,80 7,99 <5,10
Дочь (II.2) 7,55 0,66 1,18 6,07 <4,44
Внучка (III.1) 6,43 0,87 1,05 4,99 <4,00
Здоровый родственник
Сын (II.1) 5,60 1,30 1,07 3,94 <4,05
Примечание. ТГ - триглицериды; ЛПВП и ЛПНП - липопротеиды высокой и низкой плотности. * - значения ниже 95-й персентили для московской популяции [27].

Обсуждение

За последние годы накопились убедительные доказательства эффективности первичной профилактики ИБС с помощью гиполипидемических препаратов и диеты [5, 20]. Первичная профилактика может быть особенно важна для пациентов с СГХС, у которых наблюдаются очень высокие уровни ХС и для которых характерно "агрессивное" развитие атеросклероза [2, 21]. Перспективным методом диагностики этого распространенного наследственного заболевания является анализ генных перестроек, приводящих к нарушению функционирования ЛПНП-рецептора [10]. В отличие от клинических методов этот подход в ряде случаев позволяет определить наличие СГХС до появления повышенного уровня липидов и развития ИБС. Особенно эффективно применение методов ДНК-диагностики при обследовании родственников больных с СГХС, в том числе их детей. Ранняя и однозначная постановка диагноза СГХС имеет существенное практическое значение. Поскольку даже у лиц с нормальным уровнем ХС атеросклероз начинает развиваться уже в детском возрасте [22], эксперты ВОЗ рекомендуют начинать лекарственную гиполипидемическую терапию у детей с верифицированной СГХС очень рано, иногда в возрасте до 10 лет [10].

В настоящее время идет активное накопление данных о мутациях в гене ЛПНП-рецептора. Уже описано несколько сотен различных наследственных аномалий этого белка [18, 19]. Характерно, что в любой популяции и даже стране набор мутаций ограничен и составляет лишь небольшую часть от общего количества перестроек, обнаруженных во всем мире, что суживает круг поиска и упрощает скрининг групп риска СГХС. Применение метода ДНК-анализа для диагностики СГХС в нашей стране затруднено в связи с тем, что спектр мутаций в России практически не изучен. Имеющиеся очень ограниченные данные позволяют предположить, что для русского населения характерно наличие специфического набора мутаций [23-25]. Полученные нами результаты являются еще одним свидетельством в пользу этого предположения, поскольку обнаруженная нами мутация 230insG ранее не была описана. Продолжение исследований генетической структуры СГХС в России позволит создать высокопроизводительные методы скрининга пациентов на наиболее распространенные типы мутаций. Весьма перспективной в этом плане представляется микрочиповая ДНК-технология, возможности которой позволяют путем гибридизации ДНК пациента с разнообразными аллель-специфическими олигонуклеотидами одновременно определять наличие десятков, сотен и даже тысяч разнообразных мутаций [26].

Кардиология, N 2-2000, стр. 4-7

  CПИСОК СТАТЕЙ

 

Сайт создан в системе uCoz
В нашей компании Вы всегда сможете найти качественные сумки из Китая самых последних моделей.