Доклиническая диагностика семейной гиперхолестеринемии с помощью анализа ДНК

С. Р. Крапивнер, П. П. Малышев, А. Б. Полтараус, А. Н. Мешков, В. В. Кухарчук, В. Н. Бочков

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва

Ключевые слова:

семейная гиперхолестеринемия, ЛПНП-рецептор, мутация.

Многочисленные исследования убедительно показали, что повышенный уровень холестерина (ХС) в крови сопровождается увеличением риска развития атеросклероза и его осложнений [1]. Этот риск особенно велик при первичных моногенных гиперхолестеринемиях, наиболее изученной формой которых является семейная гиперхолестеринемия (СГХС) [2]. При этом заболевании в результате мутации нарушается функционирование мембранного белка-рецептора липопротеидов низкой плотности (ЛПНП-рецептора). Этот наследственный дефект приводит к снижению клиренса липопротеидных частиц и вследствие этого к резкому повышению уровня ХС в плазме крови [3]. В настоящее время разработаны разнообразные лекарственные и афферентные способы коррекции гиперхолестеринемии [1, 4]. Клинические исследования продемонстрировали высокую эффективность этих методов для первичной и вторичной профилактики атеросклероза, в том числе у больных с СГХС [5-9]. К сожалению, клиническая и биохимическая диагностика СГХС сопряжена с определенными сложностями, вследствие чего даже в лучших клиниках диагноз СГХС в большинстве случаев ставится лишь после появления клинической симптоматики [4]. В результате диетические и лекарственные способы первичной профилактики атеросклероза у таких больных не используются в должной мере. Согласно оценкам экспертов ВОЗ, наиболее эффективным способом обнаружения СГХС на доклинической стадии является анализ ДНК родственников больных с установленным генетическим дефектом [10]. В настоящей работе этот подход был применен для проведения доклинической диагностики в семье пробанда, у которого мы обнаружили не описанную ранее перестройку в гене ЛПНП-рецептора. В результате ДНК-обследования трех поколений этой семьи, помимо пробанда, были обнаружены два носителя мутации, у которых атеросклероз не достиг клинической стадии.

Материал и методы

В работе использованы соли и буферы производства фирмы "Sigma" (США), реактивы для электрофореза и стандарты размера ДНК фирмы "Life Technologies" (Ве-ликобритания), а также реактивы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) фирмы "Promega" (США). Скрининг на выявление мутаций в гене ЛПНП-рецептора проведен среди больных с клиническими признаками СГХС, наблюдавшихся в Институте клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздрава Российской Федерации. Большинство обследованных были русской национальности и проживали в Москве и Московской области. Диагноз СГХС ставили на основании следующих критериев: при уровне общего ХС выше 7,8 ммоль/л, наличии сухожильных ксантом у обследуемого или родственников первой степени родства и отсутствии заболеваний, приводящих к развитию вторичной гиперлипопротеидемии, таких как сахарный диабет, гипотиреоз и нефротический синдром.

Анализ липидов крови проводили на анализаторах "Technicon-RX" (фирма "Technicon", США) и "Spectrum" (фирма "Abbott Laboratories", США). ХС ЛПВП определяли в супернатанте после преципитации апо-B-содержащих липопротеидов декстрансульфатом.

ДНК выделяли из крови или буккального мазка обследуемых лиц с помощью стандартных процедур [11]. ПЦР (35 циклов) проводили в термоциклере фирмы "Hybaid" при следующих условиях: денатурация (94°С, 30 с), отжиг (57°С, 30 с) и элонгация (72°С, 32 с). В конце реакции пробирки дополнительно инкубировали при 72°С в течение 10 мин. ПЦР проводили в объеме 20 мкл в растворе следующего состава: 100 мМ трис-HCl, pH 8,3 (25°С), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl₂, четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (каждый в концентрации 100 мкМ), по 10 пмоль каждого праймера, 2 ед. Taq-полимеразы и 1 мкг геномной ДНК. Для амплификации 3-го экзона гена ЛПНП-рецептора использовали следующие праймеры [12]: 5'-TTCCTTTGAGTGACAGTTCAATCC-3' и 5'-GAT-AGGCTCAATAGCAAAGGCAGG-3'.

После окончания ПЦР 3 мкл продукта смешивали с 20 мкл 7,5% раствора фикола-400 и 0,025% ксиленцианола FF, нагревали 2 мин при 95°С, после чего пробирки немедленно помещали на лед. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в неденатурирующем полиакриламидном геле (T=15%, C=2%) размером 160Х140Х0,75 мм. В качестве гелевого и электродного буфера использовали 1ХTBE. Форез проводили в течение ночи при 4°С и фиксированной силе тока 10 мА/гель. После окончания электрофореза гель окрашивали серебром [13]. Амплифицированные фрагменты из образцов с аномальной картиной миграции одноцепочечной ДНК очищали из исходной ПЦР-смеси электрофорезом в 8% полиакриламидном геле в TBE-буфере без предварительной денатурации, после чего их обнаруживали в геле с помощью бромистого этидия, вырезали и элюировали из геля водой. После переосаждения и измерения концентрации полученную ДНК секвенировали.

Результаты исследования

Для поиска мутаций в гене ЛПНП-рецептора мы использовали метод анализа конформации одноцепочечной ДНК с помощью гель-электрофореза [14]. В ходе скрининга больных с клиническим диагнозом СГХС мы обнаружили пациента (пробанд, обозначенный на рис.1 и 2 цифрами I.1), у которого в амплифицированном 3-м экзоне на электрофореграмме наблюда-лись дополнительные полосы (на рис. 1, А обозначены звездочками). Секвенирование ДНК пациента I.1 показало наличие в одном из аллелей дополнительного нуклеотида G после нуклеотида с порядковым номером 230 [15]. Согласно распространенной номенклатуре, такую мутацию сокращенно следует обозначать 230insG [16]. Результатом этой инсерции является сдвиг рамки считывания начиная с 57-го кодона (см. рис.1, Б). В результате образуется преждевременный стопкодон в положении 108. Таким образом, в отличие от нормальной последовательности, содержащей 860 аминокислотных остатков, мутантная мРНК кодирует сильно укороченный полипептид длиной 108 аминокислот, 56 из которых соответствуют половине лигандсвязывающего домена ЛПНП-рецептора, а остальные представляют собой бессмысленную последовательность, вызванную сдвигом рамки. На основании имеющейся информации о функциональных последствиях различных типов мутаций ЛПНП-рецептора [17] можно с высокой вероятностью предположить, что данный полипептид не способен связывать липопротеиды и скорее всего в процессе созревания не достигает клеточной поверхности. Такую мутацию можно отнести ко II функциональному классу [17]. Результатом подобных нарушений в гетерозиготном состоянии обычно является утрата половины ЛПНП-связывающей способности клеток за счет полной инактивации мутантного аллеля. Анализ электронных баз данных [18, 19] показал, что такая мутация обнаружена нами впервые и, по-видимому, является специфичной для России.